Przedłużenie prezbiterium kościoła w kierunku wschodnim utworzyło pod dodaną partią budowli, w przyziemiu nowe pomieszczenie, któremu wyznaczono funkcję kaplicy grobowej wielkich mistrzów, nadając jej wezwanie świętej Anny.

Do wnętrza kaplicy prowadziły dwa wejścia usytuowane na przeciwko siebie w ścianie północnej i południowej. Obydwa portale otrzymały niezwykle bogatą oprawę rzeźbiarską, na wzór wcześniejszej Złotej Bramy wiodącej do kościoła. Figuralne sceny w tympanonach wykonane zostały w wysokim reliefie i pokryte barwną malaturą: w portalu północnym – sceny maryjne (Pokłon Trzech Króli, Zaśnięcie i Wniebowzięcie oraz Koronacja Najświętszej Marii Panny); dopełnieniem reliefowych przedstawień tympanonu głównego był znany już ze Złotej Bramy moralizujący wątek legendy o Pannach Mądrych, prowadzonych przez anioła do bram niebios i Pannach Głupich, które diabeł wiedzie w paszczę Lewiatana. Portal południowy prezentuje sceny z cyklu chrystologicznego: Wniebowstąpienie, Sąd Ostateczny i historię znalezienia Krzyża Świętego.

W krypcie pod posadzką składano, począwszy od 1341 r., doczesne szczątki najwyższych dostojników Zakonu. Jako pierwszy spoczął w niej wielki mistrz Dietrich von Altenburg, ogółem spoczęło ich tu jedenastu. Pamiątką po nich są dziś trzy oryginalne, kamienne płyty nagrobne Dietricha von Altenburg, Heinricha Dusemera i Heinricha von Plauen.

Po przekazaniu zamku malborskiego w ręce Kazimierza Jagiellończyka, kaplica św. Anny znajdowała się pod patronatem królów polskich. Przez długi czas zachowała ona zapewne wyposażenie z czasów krzyżackich i była sporadycznie wykorzystywana do celów religijnych. Podczas wojen szwedzkich w XVII w. była dwukrotnie profanowana, obrabowana i pozbawiona wyposażenia. W roku 1652 król Jan Kazimierz przekazał kaplicę jezuitom malborskim, którzy jednak nie przejęli beneficjum przed wybuchem II wojny szwedzkiej (1656). Przez kolejne lata kaplica była w złym stanie technicznym. Ostatecznie darowiznę Jana Kazimierza potwierdził ponownie biskup chełmiński i pomezański Teodor Potocki w 1707 r. Kaplica została wówczas wyremontowana na koszt ekonomii malborskiej i rekoncyliowana, stając się miejscem pochówku jezuitów malborskich. Pierwszy jezuita został w niej pochowany w 1708 r. Łącznie do roku 1788 pochowano w kaplicy św. Anny przynajmniej 24 ustalonych z nazwiska zakonników. W 1737 r. ekonom i starosta malborski Michał Ernest Rexin (1698–1768), konwertyta i dobrodziej malborskich jezuitów przebudował zachodnią część kaplicy na mauzoleum rodowe. W celu budowy krypty wspomniana część kaplicy została oddzielona murem. Następnie ponad kryptą wykonano przejście a obydwa leżące po przeciwnych stronach kaplicy okna zostały przebudowane na drzwi prowadzące do wnętrza mauzoleum. Po roku 1780 kaplica przejęta została przez duchowieństwo parafialne, a w latach 1821-1823 została wyremontowana i przywrócona do wcześniejszego stanu. Podczas prac trumny z pochówkami jezuickimi złożone w krypcie krzyżackiej usunięto i pogrzebano w krypcie Rexinów. Mur oddzielający kaplicę od krypty został wyburzony, krypta zniwelowana, zasypana i przykryta posadzką, przejście zamurowano a otwory w ścianach przemurowano na okna. Ponowną gruntowną rewitalizację oraz zmianę aranżacji wnętrza obiekt przeszedł za sprawą Conrada Steinbrechta w końcu XIX i początkach XX w. W 1945 r. podczas walk o zamek sklepienie kaplicy runęło po zawaleniu się na skutek ostrzału artyleryjskiego prowadzonego przez Armię Czerwoną znajdującego się nad nią kościoła NMP i wieży zamkowej.

Zwieńczeniem rozpoczętej w latach 60-tych XX wieku powojennej odbudowy kaplicy był projekt „Prace konserwatorskie i roboty budowlane w zespole kościoła NMP w Muzeum Zamkowym w Malborku” realizowany w okresie od 06.05.2014 r. do 30.04.2016r. Celem przedsięwzięcia było przeprowadzenie prac konserwatorskich i robót budowlanych w zespole kościoła Najświętszej Marii Panny na Zamku w Malborku, w tym wchodzącej w jego skład kaplicy św. Anny. W ramach programu wykonano w jej wnętrzach następujące prace:

rekonstrukcję wypraw tynkarskich i malarskich, odtworzenie mensy ołtarzowej, iluminację i przeszklenie krypty grzebalnej wielkich mistrzów, aranżację konserwatorską malowidła „Pokłon Madonnie dostojników i braci zakonnych poległych pod Grunwaldem” wg projektu H. Schapera na ścianie zachodniej kaplicy, witraż z przedstawieniem św. Jerzego walczącego ze smokiem w otworze okiennym na ścianie wschodniej, podczas badań georadarem w zachodniej części kaplicy odkryta została XVIII wieczna krypta rodu Rexinów, starostów i ekonomów malborskich; w trakcie przeprowadzonych badań archeologicznych odnaleziono w niej szczątki członków rodu oraz wtórne pochówki malborskich jezuitów, w miejscu dawnej krypty wymurowano nową, w której dokonano ponownego pochówku odnalezionych szczątków.